?TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC象征绿色荧光）通用型

货号:ZK-PL4019

规格：20T  50T

描述：

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的阶段性过程。。。。。染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用降落解为50-300 kb的大片段，，，，，，，，而后约莫30%的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，，，，，，，，在核幼体单元之间被随机堵截，，，，，，，，形成180-200 bp核幼体DNA多聚体。。。。。因而在细胞凋亡晚期，，，，，，，，DNA会被降解为180-200 bp的片段，，，，，，，，断裂的基因组DNA上露出出大量的3'-OH结尾。。。。。结尾脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，，，，，，，，能够催化脱氧核苷酸结合到断裂的DNA分子3'-OH结尾。。。。。因而TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)细胞凋亡检测试剂盒能够用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。。。。。其道理是在TdT酶的作用下，，，，，，，，在基因组DNA断裂时露出出的3?-OH结尾掺入荧光素象征的dUTP（FITC-12-dUTP），，，，，，，，从而能够用荧鲜明微镜或流式细胞仪检测（FITC引发450-500 nm，，，，，，，，发射515-565 nm）。。。。。

本试剂盒利用领域广，，，，，，，，合用于石蜡组织切片，，，，，，，，冰冻组织切片、细胞爬片、细胞涂片等的细胞凋亡检测。。。。。

贮存与运输：冰袋运输；；；；；；；

               本试剂盒贮存在-20℃，，，，，，，，FITC-12-dUTP Labeling Mix需避光贮存于-20℃，，，，，，，，有效期12个月。。。。。

尝试前筹备：

1. PBS磷酸盐缓冲液

2. 固定液：溶于PBS或其他缓冲系统的4%多聚甲醛，，，，，，，，pH 7.4

3. 破膜液：溶于0.1%柠檬酸钠的0.1% Triton X-100

4. 配造含0.2% Triton X-100的PBS；；；；；；；配造含0.1% Triton X-100及5 mg/mL BSA的PBS

5. 如需染核，，，，，，，，需自备DAPI（2 ?g/mL）或PI（1 ?g/mL）

6. 如需阳性对照尝试，，，，，，，，需自备DNase I

7. 若是用流式细胞仪，，，，，，，，自备PI染液和RNase A（DNase free）

8. 操作时请穿尝试服，，，，，，，，佩带一次性手套。。。。。

操作步骤：

一、样品筹备

A. 石蜡包埋组织切片

1. 室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5-10 min，，，，，，，，沉复2-3次；；；；；；；而后无水乙醇浸泡5 min，，，，，，，，沉复2次；；；；；；；最后用梯度乙醇（85%、75%、双蒸水）各浸

泡1次，，，，，，，，每次5 min；；；；；；；

2. 用PBS轻轻润洗切片，，，，，，，，并去掉样本周围有余液体；；；；；；；使用组化笔沿组织表围概括画一个与组织距离2-3 mm的幼圈，，，，，，，，便于下游通透性处置和平衡象征操

作；；；；；；；在尝试过程中，，，，，，，，切勿让样品干燥，，，，，，，，处置好的样本放在湿盒中维持样本的湿润；；；；；；；

3. 配造Proteinase K工作液：按1：9的比例，，，，，，，，用PBS作为稀释液来稀释Proteinase K（200 ?g/mL）原液，，，，，，，，使其终浓度为20 μg/mL；；；；；；；

4. 每个样本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，，，，，，，，使其被全数覆盖，，，，，，，，37℃孵育20 min；；；；；；；

（注：Proteinase K处置重要有助于组织和细胞后续步骤的染色试剂通透，，，，，，，，其孵育功夫过长过短城市影清脆续象征效能，，，，，，，，为得到更好的结

果，，，，，，，，能够优化Proteinase K孵育的功夫）

5. 用PBS溶液浸润洗濯样本3次，，，，，，，，每次5 min（Proteinase K需洗涤干净，，，，，，，，不然会滋扰后续的象征反映），，，，，，，，处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿

润；；；；；；；

6. （可选步骤）去掉样本上有余的液体，，，，，，，，将适量破膜液（溶于0.1%柠檬酸钠的0.1% Triton X-100）滴加到组织上，，，，，，，，充分浸润组织，，，，，，，，室温处置20

min；；；；；；；破膜处置实现后同样的用PBS溶液润洗样本3次，，，，，，，，每次5 min；；；；；；；处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿润。。。。。

B. 组织冰冻切片

1. 将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，，，，，，，，室温下孵育10-15 min；；；；；；；

2. 片子从固定液中取出后，，，，，，，，透风橱中天然晾干；；；；；；；

3. 将玻片放入纯水或PBS中润洗，，，，，，，，去掉玻片上残存的固定液；；；；；；；

4. 用组化笔沿着组织表围概括画一个与组织距离2-3 mm的幼圈，，，，，，，，便于下游通透性处置和平衡象征操作；；；；；；；在尝试过程中，，，，，，，，切勿让样品干燥，，，，，，，，处置好的样

本放在湿盒中维持样本的湿润；；；；；；；

5. 配造Proteinase K工作液：按1：9的比例，，，，，，，，用PBS作为稀释液来稀释Proteinase K（200 ?g/mL）原液，，，，，，，，使其终浓度为20 μg/mL；；；；；；；

6. 每个样本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，，，，，，，，使其被全数覆盖，，，，，，，，室温孵育10 min；；；；；；；

（注：Proteinase K处置重要有助于组织和细胞后续步骤的染色试剂通透，，，，，，，，其孵育功夫过长过短城市影清脆续象征效能，，，，，，，，未得到更好的结

果，，，，，，，，可能必要优化Proteinase K孵育的功夫）

7. 用PBS溶液润洗样本2-3次，，，，，，，，去掉有余液体（Proteinase K需洗涤干净，，，，，，，，不然会滋扰后续的象征反映），，，，，，，，处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿

润；；；；；；；

8. （可选步骤）将适量破膜液（溶于0.1%柠檬酸钠的0.1% Triton X-100）滴加到组织上，，，，，，，，充分浸润组织，，，，，，，，室温处置20 min，，，，，，，，破膜处置实现后同样的

用PBS溶液润洗样本，，，，，，，，去掉

有余液体，，，，，，，，处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿润。。。。。

C. 细胞爬片

1. 在Lab-Tek载玻片幼室（Chamber Slides）上造就贴壁细胞，，，，，，，，在凋亡诱导处置之后，，，，，，，，用PBS轻轻润洗2遍载玻片；；；；；；；

2. 向每个载玻片幼室中参与适量的4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）固定，，，，，，，，室温下孵育20 min；；；；；；；

3. 去掉固定液，，，，，，，，参与PBS洗濯3次，，，，，，，，每次5 min；；；；；；；

4. 每个样本浸于0.2%配造于PBS中的Triton X-100溶液中，，，，，，，，室温孵育5 min进行通透处置；；；；；；；

5. 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没洗濯样本2-3次；；；；；；；

6. 轻轻去掉有余液体，，，，，，，，并用滤纸幼心吸干载玻片上样本周围的液体。。。。。处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿润。。。。。

D. 细胞涂片

1. 以约2×107个细胞/mL的浓度将细胞沉悬于PBS中，，，，，，，，汲取50-100 μL细胞悬液滴于防脱玻片上，，，，，，，，使用一片干净的载玻片柔和涂开细胞悬液；；；；；；；

2. 将玻片浸入装有4%新鲜配造于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，，，，，，，，固定细胞，，，，，，，，在4℃搁置25 min；；；；；；；

3. 将玻片浸入PBS中，，，，，，，，室温搁置5 min浸洗，，，，，，，，沉复一次；；；；；；；

4. 轻轻去掉有余液体，，，，，，，，并用滤纸幼心吸干玻片上样本周围有余的液体，，，，，，，，用组化笔沿着细胞表围概括画一个幼圈，，，，，，，，便于下游透性处置和平衡象征操作，，，，，，，，

在尝试过程中，，，，，，，，切勿让样

品干燥；；；；；；；

5. 每个样本浸于0.2%配造于PBS中的Triton X-100溶液中，，，，，，，，室温孵育5 min进行通透处置；；；；；；；

6. 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没洗濯样本2-3次；；；；；；；

7. 轻轻去掉有余液体，，，，，，，，并用滤纸幼心吸干载玻片上样本周围的液体，，，，，，，，处置后的样本放在湿盒中维持样本的湿润。。。。。

二、DNase I处置阳性对照尝试（可选步骤）

在样本通透处置后，，，，，，，，用DNase I处置样正本筹备阳性对照。。。。。

1. 将100 μL 1×DNase I Buffer（配造步骤：取10 μL 10×DNase I Buffer，，，，，，，，而后参与90 μL去离子水混匀）滴加到已通透的样本上，，，，，，，，室温孵育5

min；；；；；；；

2. 轻轻去掉有余液体，，，，，，，，参与100 μL含有DNase I（20 U/mL）的工作液（配造步骤：取10 μL 10×DNase I Buffer，，，，，，，，而后参与2 μL DNase I，，，，，，，，再加

入88 μL去离子水混匀），，，，，，，，室温

孵育10 min；；；；；；；

3. 轻轻去掉有余的液体，，，，，，，，并将载玻片在装有PBS的染色缸中彻底洗3-4次。。。。。

(注：阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸，，，，，，，，不然阳性对照载玻片上残留的DNase I可能会在尝试载玻片上引入高布景)

三、象征与检测

1. 平衡：每个样本滴加50 μL Equilibration Buffer使其全数覆盖待检样本区域，，，，，，，，室温孵育10 min；；；；；；；

2. 象征液配造：在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，，，，，，，，并依照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP

Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 ?L：5 ?L：50 ?L（1：5：50）比例混合足够用于所有尝试的TdT孵育缓冲液，，，，，，，，具体尝试使用试剂

的体积能够凭据玻片的大幼进行适当等比例调整；；；；；；；

3. 阴性对照系统：筹备一份不含Recombinant TdT enzyme的对照TdT孵育缓冲液，，，，，，，，用ddH2O代替；；；；；；；

4. 象征：尽量去掉平衡的Equilibration Buffer，，，，，，，，而后在每份组织样本上参与56 μL TdT孵育缓冲液，，，，，，，，在37℃孵育1 h；；；；；；；把稳不能干片，，，，，，，，载玻片要

避光；；；；；；；

5. 立即用PBS润洗组织样本，，，，，，，，洗濯4次，，，，，，，，每次5 min；；；；；；；

6. 用滤纸轻轻擦掉样本周围的PBS溶液；；；；；；；

7. 核染色：样本在染色缸中染色，，，，，，，，在阴郁中将载玻片浸入装有PI溶液或者DAPI溶液（用PBS新鲜配造并稀释）的染色缸，，，，，，，，室温搁置8 min；；；；；；；

8. 封片：样本染色实现后，，，，，，，，用PBS洗濯组织样本3次，，，，，，，，每次5 min，，，，，，，，而后轻轻去掉有余液体，，，，，，，，滴加抗荧光淬灭封片剂封片；；；；；；；

9. 镜检：立即在荧鲜明微镜下分析样本，，，，，，，，载玻片把稳避光，，，，，，，，PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，，，，，，，，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-

dUTP掺入而定位的绿色荧光。。。。。

四、利用流式细胞术检测悬浮细胞

1. 将待检测细胞用PBS洗濯两次，，，，，，，，4℃离心（500g）而后沉悬在500?LPBS中；；；；；；；

2. 固定：向样品中参与5mL1%用PBS配造的多聚甲醛溶液，，，，，，，，固定细胞，，，，，，，，冰上搁置20 min；；；；；；；

3. 细胞在4℃，，，，，，，，300 g离心10min，，，，，，，，去上清并用5mLPBS沉悬两次，，，，，，，，最后用500?LPBS沉悬细胞；；；；；；；

4. 通透：向样品中参与5mL冰上预冷的70%乙醇，，，，，，，，-20℃孵育4h，，，，，，，，通透细胞；；；；；；；

（注：细胞也可用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室温5 min进行通透）

5. 细胞用300g离心10min后用5mLPBS沉悬，，，，，，，，再次离心后用1mLPBS沉悬；；；；；；；

6. 平衡：转移约2×106个细胞至1.5 mL的微量离心管，，，，，，，，300 g离心10 min，，，，，，，，去上清，，，，，，，，并用80 μL Equilibration Buffer沉悬，，，，，，，，室温孵育5 min；；；；；；；

7. 象征液配造：在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，，，，，，，，并依照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP

Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 ?L：5 ?L：50 ?L（1：5：50）比例混合足够用于所有尝试和可选阳性对照反映的TdT孵育缓冲

液；；；；；；；

8. 象征：细胞用300g离心10min，，，，，，，，去上清将沉淀沉悬在56μLTdT孵育缓冲液中，，，，，，，，37℃孵育1h，，，，，，，，避光。。。。。每隔15min用微量移液器轻轻沉悬细胞；；；；；；；

9. 反映实现后参与1mL20mM EDTA终止反映，，，，，，，，用微量移液器柔和混匀；；；；；；；

10. 300g离心10min，，，，，，，，去上清并将沉淀沉悬在1 mL用PBS配造的0.1% Triton X-100溶液中，，，，，，，，其中含5 mg/mL BSA，，，，，，，，沉复洗2次；；；；；；；

11. 核染色：300g离心10min，，，，，，，，去上清并将细胞沉淀沉悬在0.5mLPI溶液中，，，，，，，，其中蕴含250μg无DNA酶的RNase A，，，，，，，，在阴郁中室温孵育细胞30 min；；；；；；；

12. 上机检测：流式细胞仪分析细胞，，，，，，，，PI能将凋亡和未凋亡的细胞均染成红色，，，，，，，，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。。。。。