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乐投letou生物报路：冷冻电子断层成像（cryo-ET）是在原位环境下发现并解析新结构，，，，，，实现跨尺度生物成像的沉要结构生物学伎俩。。。。。近年来cryo-ET领域蓬勃发展：一方面，，，，，，cryo-ET数据采集及后续数据处置步骤的技术改革带来了分辨率的革命性突破；；；；；；；；另一方面，，，，，，细胞环境下的指标鉴别技术及减薄冷冻细胞样品技术的发展，，，，，，使在10万倍放大倍数下直接观察生理前提下细胞内的生物学过程成为可能。。。。。这两方面的改革相辅相成，，，，，，极大地推进了在宿主细胞中原位高分辨观测病毒活动的钻研新方向（图1），，，，，，为病毒学钻延注药物疫苗开发提供了贵重的原位机造发现。。。。。

2023年5月10日，，，，，，清华大学性命学院李赛团队在Annual Review of Biophysics颁发题为《冷冻电子断层成像的分辨率革命及伴随涌现的原位病毒学发现》（Cryo-Electron Tomography: The Resolution Revolution and a Surge of In Situ Virological Discoveries）的综述文章。。。。。该文章系统总结了cryo-ET领域近年来的技术改革、分辨率突破及伴随其涌现的原位结构病毒学发现，，，，，，并对该领域的将来钻研进行了瞻望。。。。。

添补空缺：cryo-ET添补传统生物显微技术的空缺地带

每种生物成像技术都有各自善于的观测尺度和对应的分辨率领域。。。。。在传统结构生物学技法术十纳米的观测尺度到光学显微成像技法术百纳米的分辨率之间存在着一个数量级的“空缺地带”，，，，，，而cryo-ET技术的观测尺度及分辨率刚好能够美满添补这一空缺（图1）。。。。。

Cryo-ET技术通过对样品多个角度拍照获得倾转系列（tilt series, TS），，，，，，将其沉构为三维断层图像，，，，，，再使用子断层均匀法（sub-tomogram averaging, STA）进行高分辨率结构解析。。。。。相比传统的冷冻电镜步骤，，，，，，cryo-ET技术有着优良的层析能力，，，，，，对样品纯度要求较低，，，，，，无需使其脱离原生环境，，，，，，能最大水平保留生物样品的天然状态。。。。。因而对于尺度在100纳米左右，，，，，，结构状态均一性较差，，，，，，且难以体表沉组表白的囊膜病毒而言，，，，，，cryo-ET可谓是极佳的钻研步骤。。。。。近5年来，，，，，，cryo-ET迎来全面发展，，，，，，层出不穷的技术改革在不休拓展其观测领域与分辨率极限，，，，，，使分歧尺度生物样品的原位观察越发流畅天然。。。。。

图1：Cryo-ET添补传统显微及结构生物学技术的空缺地带（Sai Li; Trends in Biochemical Sciences, 2022; 47(2): 173-186）

Cryo-ET的分辨率革命：为原位观测大分子机械近原子分辨率结构打开崭新窗口

Cryo-ET面对的生物系统复杂，，，，，，采集的数据规模重大，，，，，，处置起来环节繁多。。。。。因而，，，，，，从造样到采集数据，，，，，，再到结构解析，，，，，，cryo-ET的工作流程存在多个影响分辨率的成分。。。。。这也成为造约cryo-ET分辨率突破的重要原因。。。。。本综述针对当前让人应接不暇的数据处置软件和流程进行了全面而详细的梳理：别离早年期的数据采集、预处置和后期结构推算三个方面，，，，，，筛选出具佑装里程碑”意思的突破性技术，，，，，，并总结了“冷冻电镜分辨率革命”以来cryo-ET近十年的技术发展以及对应的分辨率突破（图2）。。。。。

在前期数据采集及处置方面，，，，，，本文别离总结了最大水平保留数据高分辨信息的倾转系列采集规划，，，，，，以及提高倾转系列采集通量的步骤学索求过程，，，，，，并梳理了针对倾转系列数据特点进行位移校对（motion correction）、衬度传递函数校对（CTF correction）、倾转系列对齐（tilt-series alignment）以及断层图像沉构（tomogram reconstruction）在内的算法改革。。。。。后期结构推算方面，，，，，，本文总结了利用人为智能辅助颗粒遴选的步骤，，，，，，及Relion 4，，，，，，Warp & M，，，，，，EMClarity等软件在颗粒对齐、分类、均匀及循环纠正等步骤的算法创新。。。。。这些数据采集规划及处置算法的改革，，，，，，逐步将cryo-ET的分辨率推动至如今的2-3埃，，，，，，最终迎来了cryo-ET领域的分辨率革命，，，，，，从而为原位观测大分子机械精密结构钻研打开崭新窗口。。。。。

图2：“冷冻电镜分辨率革命”以来，，，，，，cryo-ET近十年的分辨率发展。。。。。一系列沉要的技术改革，，，，，，推动了cryo-ET的分辨率革命

眼见为实：一系列原位结构生物学技术的发展，，，，，，正将病毒性命周期的“示意图”转变为“结构现实”

全面相识病毒在宿主体内的性命周期是病毒学钻研的沉中之沉，，，，，，基于此我们能力从中发现缝隙，，，，，，筛选靶点，，，，，，有针对性地开发抗病毒药物及抗体。。。。。从一颗病毒入侵宿主细胞到大量子代病毒的开释，，，，，，病毒在细胞内的行为千差万别，，，，，，花腔繁多。。。。。曾几何时，，，，，，我们关于病毒“性命周期”的理解，，，，，，重要来自于传统职能学尝试、荧鲜明微镜及常温切片电镜观测。。。。。然而，，，，，，随焦急剧投入式冷冻造样、高压冷冻造样、冷冻光电结合成像（cryo-CLEM）、电镜可见的特异性生物象征、冷冻聚焦离子束减。。。。。╟ryo-FIB milling）、相位板（VPP）、基于人为智能的图像鉴别、降噪和图形宰割等一系列cryo-ET有关技术的发展，，，，，，病毒性命周期的“示意图」佚逐步转变为“结构现实”。。。。。

本文别离梳理了真核细胞及原核细胞内病毒的性命周期，，，，，，并将其划分为三个阶段：第一阶段：病毒入侵宿主细胞，，，，，，开释基因组；；；；；；；；第二阶段：病毒诱导细胞内形成复造工厂并进行基因组的大量复造；；；；；；；；第三阶段：子代病毒组装成型并脱离宿主细胞开启新一轮习染。。。。。同时，，，，，，本文具体综合了以上病理过程中的沉要大分子结构，，，，，，例如病毒复造工厂的孔路复合物、处于分歧过程的病毒组装中央体以及在向宿主递送基因组的噬菌体分子机械等。。。。。近五年来，，，，，，此类钻研成就急剧涌现，，，，，，大量不为人知、甚至曾被谬误理解的病毒活动，，，，，，终于得到眼见为实的证据（图3）。。。。。这些发现为药物靶点选择提供了有力的参考信息。。。。。

图3：通过揭示细胞内病毒活动的原位机造，，，，，，cryo-ET正逐步将病毒性命周期的“示意图”转变为“结构现实”

分辨率革命只是起头：瞻望Cryo-ET的技术发展

本综述不仅对cryo-ET近十年来的技术改革和分辨率发展进行了详细的梳理，，，，，，也综合了cryo-ET揭示的病毒沉要原位结构及入侵、复造机造。。。。。随着cryo-ET技术的的不休发展，，，，，，它不仅为微生物领域带来大量新发现，，，，，，也被宽泛利用在神经生物学、细胞生物学、植物等领域。。。。。

然而，，，，，，作为一门年轻的技术，，，，，，cryo-ET领域仍有大量难题亟待解决。。。。。首先，，，，，，相较于传统的冷冻电镜单颗粒分析技术，，，，，，cryo-ET的工作流程整体越发复杂耗时且分辨率较低。。。。。本文指出开发可矫捷组合使用的整合工具包将极大提升cryo-ET的工作效能。。。。。要提升子断层均匀结构的分辨率必要从低信噪比数据中尽量齐全有效地提取高频信息用于推算，，，，，，这是cryo-ET结构推算领域的一大沉要指标。。。。。此表，，，，，，电镜图像虽能保留大量高频信息但其信噪比力低，，，，，，时时难以锁定细胞内的指标分子。。。。。为此，，，，，，结合其他显微伎俩，，，，，，并通过开发新型样品特异性象征方式，，，，，，能够援手我们在细胞内寻找感兴致的生物学事务。。。。。